| 诺如病毒是一类引起急性非细菌性胃肠炎的RNA病毒,它的主要结构蛋白的P区域包含受体结合区和主要抗原位点。通过大肠杆菌表达P区域可形成P颗粒,P颗粒的抗原性及受体结合功能与天然病毒极为相似,可以用于制备快速检测诺如病毒的单克隆抗体,基本过程如下:
Ⅰ.获取P颗粒基因:提取诺如病毒的RNA,以相应的RNA片段为模板,利用酶合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,从而快速获得大量P颗粒基因。
Ⅱ.形成重组DNA分子:该过程常用不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒,目的是防止目的基因和载体的自身环化及。
Ⅲ.重组DNMA分子导入受体细胞及筛选:用处理大肠杆菌,可提高转化效率,重组质粒通常需具有目的基因、复制起点、转录起始位点、及标记基因等功能序列,从而保证其正常复制、表达及便于后续筛选。
Ⅳ.P颗粒基因的表达:筛选过的大肠杆菌表达P颗粒基因,分离提取P颗粒。
Ⅴ.单克隆抗体的制备与检测:将P颗粒注射到小鼠体内,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤通过化学物质诱导细胞融合。接着进行两次筛选,第一次筛选出杂交瘤细胞:第二次筛选出。单克隆抗体可用于诊断是否感染诺如病毒,这种诊断运用了杂交技术,单克隆抗体的优点是。 |