组织型纤溶酶原激活剂（tPA）在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用，如图是利用奶牛乳汁生产组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的图解，据图回答下列问题：

（1）过程①在构建的基因表达载体中，应将tPA基因首端与 基因的启动子等调控组件结合，③过程常用的方法是 ．

（2）要获得单个成纤维细胞，过程②需用 处理奶牛胎儿皮肤组织块．在单个组织细胞的培养过程中，为了防止杂菌污染，通常还要在细胞培养液中添加一定量的 ．

（3）成功进入成纤维细胞的tPA基因，最终在转基因牛C中维持稳定和表达的过程称为 ，④涉及到的生物技术为  ， 得到的转基因牛C称之为转基因克隆动物．

（4）从A到B过程中所用的胚胎工程技术是 ．从个体水平上看，若 ， 则可确定转基因牛培育成功．

临床上治疗大面积创伤时，可将经特殊处理的猪皮移植到患者的创面处，并在猪皮上开若干个小口植入患者的自体皮，待其生长并最终替换猪皮．研究表明，导入人P基因的转基因猪所提供的“皮肤”可在移植后存活更长时间，能够保证自体皮充分生长．下图为获得这种转基因猪的操作流程，请回答：

（1）过程①中，常用酶处理，获得的成纤维细胞在体外培养时需一些适宜的条件，包括环境、营养、适宜的温度和pH、 等条件．

（2）过程②常用的方法是 ，检测P基因是否已整合到了成纤维细胞的染色体上，可采用 技术．

（3）过程③采用的是 技术；过程⑤为技术．

（4）细胞B最终能发育成转基因猪，体现了 ．

（5）应用图中③技术可得到人的早期胚胎，并从中分离出 ，用于医学研究和治疗，这种方法称为治疗性克隆．我国对此类研究所持的态度是

（1）基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性．利用基因工程等技术培育转基因生物时，基因工程的四步骤如下：

第一步：目的基因的获取．获取方法有 （写出两种即可）．

第二步：基因表达载体的构建．该步骤常用的工具酶是 ．完整的重组载体应具备 种特殊DNA片段．

第三步：将目的基因导人受体细胞．如受体细胞为动物的 ，则常用的方法是显微注射法；如受体细胞为微生物细胞，则用 处理细胞，使其处于感受态，然后在一定温度下重组表达载体与缓冲液混合完成转化．

第四步： ．

（2）胚胎工程主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的新技术．

①体外受精：对精于进行获能处理的方法有 ．获能的精于与成熟的卵子需在 中完成受精作用．

②早起胚胎的发育：受精卵不断增殖的过程，细胞分化最先出现在 期．

③胚胎移植：适合移植的胚胎是 ．

已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病．SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体．某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作．其简要的操作流程如下：

（1）实验步骤①所代表的反应过程是 

（2）步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制性内切酶和 酶，后者的作用是将限制性内切酶切割的和 连接起来．

（3）如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能 ，也不能 

（4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用 与进行抗原﹣﹣抗体特异性反应实验，从而得出结论．

（5）步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列 （相同、不同），根本原因是

为增加油菜种子的含油量，研究人员尝试将酶D基因与位于叶绿体膜上的转运肽基因相连，导人油菜细胞并获得了转基因油菜品种．

（1）研究人员依据基因的已知序列设计引物，采用 法从陆地棉基因文库中获取酶D基因．从拟南芥基因文库中获取转运肽基因．所含三种限制酶（ClaⅠ、SacⅠ、XbaⅠ）的切点如图所示．则用 和 酶处理两个基因后，可得到  （填图中字母）端相连的融合基因．

（2）将上述融合基因插入如图所示质粒的T﹣DNA中．构建 并导入农杆菌中．将获得的农杆菌接种在含 的固体平板上培养得到含融合基因的单菌落，再利用 培养基震荡培养，可以得到用于转化的浸染液．

（3）剪取油菜的叶片放入染液中一段时间，此过程的目的是  ． 进一步筛选后获得转获因油菜细胞．该细胞通过 技术．可培育成转基因油菜植株．

（4）提取上述转基因油菜的mRNA．在逆转录酶的作用下获得cDNA．再依据 的DNA片段设计引物进行扩增．对扩增结果进行检侧．可判断融合是否完成  ．

（5）用 法可检测转基因油菜植株中的融合基因是否成功表达．

基因工程被广泛应用于药物制备、动植物育种等，下图所示为基因工程在动物乳腺生物反应器﹣﹣转基因山羊和抗虫棉的培育过程．据图回答：

（1）在图示①过程中，使用的限制酶能够识别 的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，从而获得A．也可采用 （填技术名称）从人的DNA分子或苏云金芽孢杆菌中对已知序列的A进行分离并扩增．

（2）基因工程的关键环节之一是构建B，其完整结构至少包括 等部分，在此过程中除了使用工具酶外，还需使用的工具是 

（3）在通过⑤过程形成转基因抗虫棉时，一般要用到植物组织培养技术，但若在③过程中采用 法则不需要；在形成转基因山羊C的过程中，需要从雌性动物体内取出卵，在②过程中通过 将目的基因导入 ，在形成转基因山羊的过程中除了基因工程技术外，还需要用到 技术．

（4）由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用 ， 表明目的基因已形成蛋白质产品．

图为利用生物技术获得生物新品种的过程示意图．据图回答：

（1）甲图所示为 技术，可以用来扩增目的基因．此过程中所使用的酶是 

（2）乙图为获得抗虫棉技术的流程．A过程需要的酶有 、 ．图中将目的基因导入植物受体细胞采用的方法是 ． 在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长．则C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入 

（3）检测目的基因是否转录出mRNA的具体方法是使用标记的与提取出的 做分子杂交．

如图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病（基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素的过程设计图解，请据图回答：

（1）图中①所示的结构是 ；②所示的结构是 

（2）图中③所示的生物工程技术是 ；④所示的生物工程技术是 

（3）在图中④所示的生物工程技术中，健康胰岛B细胞基因在进入②之前要构建 ，这是基因工程的核心，除含目的基因外，还必须含有启动子、终止子、标记基因．

（4）重组细胞b在一定的细胞分化诱导剂的作用下，可以定向分化形成胰岛B细胞，其根本原因是 ．培养重组细胞b的培养液中除加入各种营养物质外，还必须加入 

（5）图示方法与一般的异体移植相比最大的优点是

2015年，屠呦呦因发现青蒿素治疗疟疾的新疗法获奖．工业上青蒿素一般从青蒿植株中提取，产量低，价格高．基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的青蒿提供了思路．科学家先通过紫外线处理大量青蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株．通过基因测序发现该高产植株控制青蒿素合成相关的一种关键酶的基因发生了突变．

（1）提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是 

（2）如果用青蒿某个时期mRNA反转录产生的双链cDNA片段，用该双链cDNA进行PCR扩增，进行了30个循环后，理论上可以产生约为 个DNA分子，该双链与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做青蒿的 ，获得的cDNA与青蒿细胞中该基因碱基序列 （填“相同”或“不同”）．

（3）将获得的突变基因导入普通青蒿之前，先构建基因表达载体，图l、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答：

用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 ，构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是 识别结合位点．

（4）检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取 技术．目的基因导入组织细胞后，通过 技术培育出青蒿幼苗．