几种限制酶识别序列及切割位点表

（1）如果要将耐盐碱基因和质粒重组，必须对基因进行修饰和改造：在基因两侧的A和B位置分别加入 限制酶识别序列，这样才有利于目的基因和质粒定向连接．

（2）过程②采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系需加入引物Ⅰ和引物Ⅱ等物质，若共用了引物Ⅱ31个，则目的基因扩增了 代．

（3）若用EcoRⅠ和PstⅠ两种限制酶同时切割载体质粒，则能形成 种不同长度的DNA片段，共有 个游离的磷酸基团．

（4）图示中将基因表达载体构建完成后没有直接导入农杆菌，而是先将其导入大肠杆菌，目的是 ．

（5）在步骤⑤⑥过程中都需用 处理两类细菌．为了确认目的基因通过⑦过程导入植物细胞中后是否成功表达，通常从分子水平进行检测的方法是用 法．

内皮素（ET）是一种含21个氨基酸的多肽，它有强烈的血管收缩和促进平滑肌细胞增殖等作用．研究发现内皮素功能异常与高血压、糖尿病、癌症等有着密切联系．内皮素主要通过与靶细胞膜上的内皮素受体结合而发挥生物学效应．ET_A是内皮素的主要受体，科研人员试图通过构建表达载体，实验ET_A基因在细胞中高效表达，为后期ET_A的体外研究以及拮抗剂的筛选、活性评价等尊定基础．其过程如下（图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为C^↓CCGGG，限制酶XhoⅠ的识别序列为C^↓TCGAG）．请分析回答：

（1）完成过程①需要的酶是 ；与过程②相比，过程①特有的碱基配对方式是 

（2）过程③中，限制酶XhoⅠ切割DNA；使 键断开，形成的黏性末端是 ．用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是 

（3）过程⑥中，要用 预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界DNA的感受态．

（4）利用SNAP基因与ET_A基因结合构成融合基因，目的是 

（5）人皮肤黑色素细胞上有内皮素的特异受体，内皮素与黑色素细胞膜上的受体结合后，会刺激黑色素细胞的分化、增殖并激活酪氨酸酶的活性，从而使黑色素急剧增加．美容时可以利用注射ET_A达到美白祛斑效果，试解释：

人外周血单核细胞能合成白细胞介素2（IL﹣2）．该蛋白可增强机体免疫功能，但在体内易被降解．研究人员将1L﹣2基因与人血清白蛋白（HAS）基因拼接成一个融合基因，并在酵母菌中表达，获得具有1L﹣2生理功能、且不易降解的1L﹣2﹣HSA融合蛋白，其技术流程如图．请回答：

（1）图中③过程的模板是 ．表达载体1中的位点 应为限制酶Bg1Ⅱ的识别位点，才能成功构建表达载体2．

（2）表达载体2导入酵母菌后，融合基因转录出的mRNA中，与1L﹣2蛋白对应的碱基序列不能含有 ，才能成功表达出IL﹣2﹣HSA融合蛋白．启动子是 识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA．

（3）培养人外周血单核细胞时，需要将温度控制在 ℃，此外还需要通入 （气体）．

（4）应用技术可检测酵母菌是否表达出IL﹣2﹣HSA融合蛋白．

（5）如果基因表达载体2导入的是优质奶牛的受精卵细胞，经胚胎培养后移入受体母牛子宫内可以存活的生理学基础是 

如图为培育转基因山羊生产人β一酪蛋白的流程图．

请回答下列问题：

（1）获取过程①所用的人β一酪蛋白基因时，可先提取人体细胞中的 ，以其作为模板在 的作用下合成 ．

（2）重组人β一酪蛋白基因表达载体中必须有启动子， 是识别和结合的部位．

（3）过程②可选用阶段的胚胎进行移植．

（4）过程③可使用技术扩大转基因山羊群体，除此之外，还可以采取的措施有（答出一点即可）．

（5）过程④人β一酪蛋白基因在细胞内表达的场所为 ．

小鼠是转基因动物研究领域中最主要的模式动物，下图是制备转基因小鼠的两种方法，请回答下列有关问题：

（1）制备转基因小鼠的原理是 ，目的基因能在小鼠体内成功表达的原因是  ， 写出目的基因表达的过程： 

（2）对转基因动物来说，一般将DNA注入胚胎干细胞的原因是 ，常用的方法是 

（3）将囊胚移入代孕鼠体内属于 技术，此技术对代孕受体的要求是 

（4）直接将目的基因注入受精卵，使外源基因整合到小鼠DNA中，是制备转基因小鼠的另一种技术，为得到较多的受精卵，需用 处理供体雌鼠，为鉴定外源基因是否成功表达，常用 技术进行检测．

农杆菌侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T﹣DNA插入到植物基因组中．图示为利用农杆菌培育转基因植物的基本流程，请据图作答：

（1）剪除Ti质粒的某些片段、替换复制原点O与添加抗生素的抗性基因T的过程①中，需用 处理DNA以防止DNA片段的自身环化，需用 “缝合”双链DNA片段的平末端．

（2）目的基因是指编码蛋白质的结构基因和一些 ．由过程②形成的运载体中，目的基因的首端具有 识别和结合的部位．

（3）过程③常用 处理使农杆菌成为感受态细胞．在过程⑤⑥前，常采用 技术检测农杆菌和愈伤组织细胞中是否有目的基因及转录产物．

（4）过程④需对植物细胞做冲洗和 处理，然后用 去除细胞壁．

p53基因是人体内一种抑癌基因．该基因编码的p53蛋白可对癌变前的DNA损伤进行修复，使其恢复正常，或诱导其进入休眠状态或细胞凋亡，阻止细胞癌变．“今又生”是我国首创的基因治疗药物之一，是世界首个获准上市的基因治疗药物，其核心成分是利用腺病毒和人p53基因拼装得到的重组病毒．“今又生”药物中的腺病毒经基因工程改造后，在宿主细胞内不能复制，不能整合到染色体上．请回答下列问题：

（1）将p53基因与腺病毒拼装成重组病毒，需要用到的工具酶有 ．常用的基因工程载体除动植物病毒外，还有 ．

（2）限制酶能将特定序列的核苷酸之间的 键切开，形成 末端．

（3）在“今义生”的生产中，科学家选择性地放弃了一般载体都应该具有的 ，以获得更高的安全性能．p53基因应插入载体的 之间，以便于基因的表达．

（4）p53基因的大量扩增可以采用PCR技术，该技术中需使用的一种特殊的酶是 ．如图是需要扩增的p53基因在DNA中的位置示意图，扩增过程需要 种引物．n次循环之后，只含目的基因的片段占所有扩增产物的比例为　 　．

将经过扩增的DNA和质粒用相同的限制酶进行如图所示的切割，电泳得到纯净的B片段和D片段，将两种片段置于适宜的缓冲液中用DNA连接酶处理．如果只考虑两个片段的环状连接，则能形成不同核苷酸序列的环状DNA的种类是（　　）

白僵菌可感染农业害虫，常作为防治害虫的菌剂．由于白僵菌对除草剂草丁膦敏感，且杀死害虫的能力较弱，科研人员对其进行基因工程改造，流程如图所示．

（1）从苏云金芽孢杆菌中获取的毒蛋白基因，通过 技术可在体外大量扩增．该扩增过程需要种引物，所需添加的酶是 

（2）图中形成重组质粒1过程需要的限制酶是 ，其作用是破坏DNA分子中的 ．

（3）将重组质粒2导入经 处理成为感受态的白僵菌．一段时间后用含有的平板培养基进行筛选，获得含有Bar基因的重组白僵菌．

（4）科研人员将重组白僵菌喷涂于植物叶片上，以此饲喂饥饿处理的害虫，记录单位时间内的 ，以判断重组白僵菌的杀虫效果．