（1）基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性．利用基因工程等技术培育转基因生物时，基因工程的四步骤如下：

第一步：目的基因的获取．获取方法有 （写出两种即可）．

第二步：基因表达载体的构建．该步骤常用的工具酶是 ．完整的重组载体应具备 种特殊DNA片段．

第三步：将目的基因导人受体细胞．如受体细胞为动物的  ， 则常用的方法是显微注射法；如受体细胞为微生物细胞，则用 处理细胞，使其处于感受态，然后在一定温度下重组表达载体与缓冲液混合完成转化．

第四步：  ．

（2）胚胎工程主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的新技术．

①体外受精：对精子进行获能处理的方法有 ．获能的精子与成熟的卵子需在 中完成受精作用．

②早起胚胎的发育：受精卵不断增殖的过程，细胞分化最先出现在 期．

③胚胎移植：适合移植的胚胎是 ．

（1）试管婴儿技术：解决了部分夫妻不育的难题或生育健康后代的要求．这种技术和母亲正常怀孕生产过程的相同之处是都是以 为发育起点，不同之处在于试管婴儿是在体外进行受精后，在试管中进行胚胎培养；最后选取健康的胚胎进行 ，保证生出健康的孩子．

（2）胚胎分割技术：可解决良种动物快速大量繁殖的问题；对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要注意  ， 否则将影响分割后的胚胎的恢复和进一步发育，如需做性别鉴定，还需从 细胞取样做DNA分析．

（3）植物体细胞杂交技术：可以用来培育一些种间亲缘关系较近的杂交种，如白菜﹣甘蓝，实质上是利用了和 两大关键技术来实现．

（4）利用基因工程培育转基因植物：如将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米细胞中，可培育转基因高赖氨酸玉米．选用的表达载体可以是农杆菌的Ti质粒，是因为该质粒的T﹣DNA能 ；除农杆菌转化法外，还有基因枪法、 法等．

（1）在哺乳动物的核移植实验中，一般通过[ ]（物理方法）将受体细胞激活，使其进行细胞分裂并发育，当胚胎发育到[ ]阶段时，将胚胎植入另一雌性（代孕）动物体内．

（2）在“试管牛”的培育过程中，要使精子和卵母细胞在体外成功结合，需要对精子进行[ ]处理．另外，培养的卵母细胞需要发育至[ ]，该时期在显微镜下可观察到次级卵母细胞和第一极体．

（3）利用体细胞进行核移植技术的难度明显高于利用胚胎细胞进行核移植的原因是[ ]．

（4）若要使获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、[ ]、终止子、标记基因和复制原点等．目前常用的措施是将该基因表达载体导入牛的[ ]（填“受精卵”或“乳腺细胞”），导入方法是[ ]．

图是利用基因工程方法培育抗虫棉的过程．请据图回答相关问题：

（1）从苏云金芽孢杆菌的DNA上获取抗虫基因，需要用到的工具是  ， 此工具主要是从 生物中分离纯化出来的，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的 键断开．

（2）构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有 ，它能把目的基因整合到受体细胞的 上．

（3）E过程是利用 技术完成，要确定抗虫基因导入棉花细胞后，是否赋予了棉花抗虫特性，在个体水平上还需要做 实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应蛋白，在分子水平上可利用 方法进行检测．

现有两种同科不同属的农作物，甲作物高产不耐盐，乙作物低产但耐盐．欲培育出既高产又耐盐的植株，以适应于盐碱地栽培．请回答下面的问题：

（1）采用 （填“杂交”、“嫁接”或“转基因”）方法可以达到上述目的，这种育种方法的优点是  ．

（2）采用细胞工程育种的方法如下：

①甲、乙原生质体经诱导融合完成的标志是  ． 以胚状体为材料，经过人工薄膜包装得到的人工种子，在适宜条件下同样能够萌发成幼苗，与天然种子相比，人工种子具有哪些显著的优点？（请举出1条）  ．

②动物细胞工程应用较广泛的是单克隆抗体的制备，单克隆抗体最主要的优点是  ． 单克隆抗体的应用主要有两个方面，一个是作为 试剂，能准确 地识别各种抗原物质的细微差别，并跟一定抗原发生 ． 另一方面可以用于 和运载药物．

随着人们生活水平的提高，乳制品需求越来越大，为了扩大生产，提高产崽率，要进行良种牛的培育．如图为胚胎移植的基本程序及早期胚胎发育过程，请据图回答：

（1）用 激素处理使供体母牛超数排卵．

（2）冲卵实质上是用特定装置将供体母牛子宫内的 冲洗出来．

（3）从A到E中，适宜于哺乳动物的胚胎移植时期有 （填图中字母）．

（4）图中标号3为 ，它将来发育为胎膜和胎盘．

（5）若一次给受体母牛移入多个胚胎，产生的多个后代基因型相同吗？为什么？ 

（6）若对A细胞利用基因工程技术加以改造，将人的血清白蛋白基因导入，在成体的雌牛的乳汁中提取出人血清白蛋白．产生该转基因牛的具体的基因工程步骤 

（7）对于植物来说，导入外源基因，容易引起基因污染，科学家就将外源基因导入叶绿体或线粒体内，原因

如图为三种质粒和一个含目的基因的片段的示意图．复制原点是质粒能正常复制的必需组成．图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoRⅠ（0.7Kb）、PvuⅠ（0.8Kb）等为限制酶及其切割的位点与复制原点的距离，1Kb=1000个碱基对长度．请据图回答：

（1）质粒A、C不能作为目的基因运载体的理由分别是 

（2）将图中的目的基因与质粒B进行重组，需要用到 酶．如果是两两重组，可能有 种长度的重组结果．

（3）基因工程中检测筛选含有目的基因的重组质粒是一个重要的步骤．现运用EcoRⅠ酶切质粒，完全酶切后进行电泳观察，若出现长度为 和 ，或者 和 的片段，则可以判断该质粒已与目的基因重组成功．

（4）若选择自身不含lacZ基因并对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，则在筛选导入成功的受体细胞时应如何操作？ 

（5）下列关于质粒运载体的说法正确的是 （多选）．

A．使用质粒运载体是为了避免目的基因被分解

B．质粒运载体只能在与目的基因重组后进入细胞

C．质粒运载体可能是从细菌或者病毒的DNA改造的

D．质粒运载体的复制和表达也遵循中心法则

E．质粒运载体只有把目的基因整合到受体细胞的DNA中才能表达

F．没有限制酶就无法使用质粒运载体．

回答下列有关基因工程的问题

经研究发现，将PVY﹣CP基因导入马铃薯，使之表达即可获得抗PVY病毒马铃薯，而PVY﹣CP基因位于某种环状DNA分子中．如图1表示获得抗病毒马铃薯的操作过程，其中①﹣⑧表示步骤，NPTⅡ基因是卡那霉素抗性基因，图中农杆菌不含此基因．表是图中限制酶识别序列和切割位点．

（1）步骤②中Klenow酶能将DNA片段的粘性末端变成平末端，且DNA长度不变，据此推测，其功能与下列酶的功能相同的是 

A．限制性核酸内切酶     B．解旋酶     C．DNA连接酶     D．DNA聚合酶

（2）由步骤②所获取的片段中，图1中BamHⅠ的酶切位点位于 

（3）由步骤③获取的目的基因有 个粘性末端；步骤④中选用的限制酶是 ；经步骤⑤所形成的结构是 

（4）为了筛选农杆菌，可以在培养基中加入 进行筛选．利用农杆菌转化法获得含目的基因的马铃薯细胞，进而通过技术获得抗PVY病毒马铃薯苗，最后进行相关的鉴定．